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常用蛋白标签的选择


 

英文缩写名称

蛋白标签描述

eGFP/eCFP

/eYFP/mCherry

       分别是增强型绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/单体红色荧光蛋白,具有不同的激发波长发射波长为,均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变和密码子优化而来。就eGFP而言,相对于GFP,其荧光强度更强、荧光性质更稳定。同时载体中构建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。mCherry是从DsRed演化来的性能最好的一个单体红色荧光蛋白,可以和GFP系列荧光蛋白共用,实现多色标记体内、外实验表明,mCherry在N端和C端融合外源蛋白时,荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能相互没有明显影响。
这些荧光标签蛋白,其融合表达目的蛋白后具有以下优点:
1.不用破碎组织细胞和不加任何底物,直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光,实时显示目的基因的表达情况,而且荧光性质稳定,被誉为活细胞探针。
2.其自发荧光,不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。
3.同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测,从而使其检测更显得快速、简便、灵敏度高而且重现性。
4.其低消耗、高灵敏度检测,十分适用于高通量的药物筛选。因此现eGFP 表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。
5.mCherry红色荧光蛋白在标记病毒颗粒,研究病毒和宿主细胞之间更有得天独厚的优势。如用mRFP或mCherry标记HIV病毒颗粒,研究H1V和宿主细胞问的相互作用以及HIV侵染宿主细胞的过程.用mRFP标记慢病毒颗粒,研究慢病毒在小鼠体内的复制过程等。
荧光素酶
来源于生物体内的荧光素,常见的有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和Guassia荧光素酶。这些荧光素酶作为“报告蛋白”被用于分子生物学研究中,这种技术被称为报告基因检测法或萤光素酶检测法(Luciferase Assay)。跟普通融合蛋白标签不
同,使用荧光素酶构建的报告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究启动子、miRNA 3'UTR克隆的功能与调控,因为它们对目的基因的调控可以是渐变的,而不是简单的开和关两种状态。
优点:灵敏度高,检测幅度宽;不是哺乳动物细胞内源性基因;重复性好;与HTS兼容等。萤火虫和海肾荧光素酶已经被广泛应用于协同报告并进行均一化研究。由于它们都是快速,容易和高灵敏的监测方法。而且萤火虫和海肾荧光素酶是理想的双基因报告系统,因为它们来源于不同的生物进化方向,蛋白结构和底物差异都很大,在实验中不会产生相互影响。
基于荧光素酶的特性,我司研发提供的Secrete-Pair? Dual Luminescence Assay Kit可用于分析双报告系统中Gaussia荧光素酶(GLuc)和分泌型碱性磷酸酶(SEAP)活性。GLuc 和SEAP均为分泌型报告蛋白,无需裂解细胞即可便捷的从细胞培养液中取得样本,并对实验结果进行精准的实时分析。

Renilla-Luc/

Guassia-Luc/

Fire-Luc

       来源于生物体内的荧光素,常见的有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和Guassia荧光素酶。荧光素酶作为“报告蛋白”用于报告基因检测法或萤光素酶检测法(Luciferase Assay)。跟普通融合蛋白标签不同,使用荧光素酶构建的报告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究启动子、miRNA 3’UTR克隆的功能与调控,因为它们对目的基因的调控可以是渐变的,而不是简单的开和关两种状态。

HA

       HA 标签(氨基酸序列:YPYDVPDYA)是一段来源于人流感病毒血凝素(HA)蛋白第 98~106 位氨基酸的短序列,分子量为 1.1 KDa,是目前广泛应用的表位标签之一,能形成强烈的抗体识别位点。 通过分子生物学手段将 HA 标签融合到目的蛋白的 C 端或 N 端后,抗 HA 标签抗体可用于 HA 标记的靶蛋白的检测、分离和纯化,而无需蛋白特异性抗体或探针。

Flag

      Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK),同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。
FLAG作为标签蛋白,其融合表达目的蛋白后具有以下优点:
1.FLAG作为融合表达标签,其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质,这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。
2.融合FLAG的目的蛋白,可以直接通过FLAG进行亲和层析,此层析为非变性纯化,可以纯化有活性的融合蛋白,并且纯化效率高。
3.FLAG作为标签蛋白,其可以被抗FLAG的抗体识别,这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
4.融合在N端的FLAG,其可以被肠激酶切除(DDDK),从而得到特异的目的蛋白。因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。

6*His

      His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签,可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用,一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力,可用于固定化金属螯合层析(IMAC),对重组蛋白进行分离纯化。
使用His-tag有下面优点:
1.标签的分子量小,只有~0.84KD,而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD,一般不影响目标蛋白的功能;
2.His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化,前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用,后者在纯化包涵体蛋白时特别有用,用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白,使复性不受其它蛋白的干扰,或进行金属螯和亲和层析复性;
3.His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究;
4.His标签免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体
5.可应用于多种表达系统,纯化的条件温和;
6.可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

GST

       GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶,它的天然大小为26KD。将它应用在原核表达的原因大致有两个,一个是因为它是一个高度可溶的蛋白,希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性;另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达,起到提高表达量的作用。GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达,可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱。在大多数情况下,融合蛋白在水溶液中是可溶的,并形成二体。GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。
纯化:该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathionesepharose)亲和树脂进行纯化。GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱,因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力,因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如:盐酸胍或尿素等。
如果要去除GST融合部分,可用位点特异性蛋白酶切除。
检测:可用GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。

HSV

       单纯疱疹病毒(HSV)来源于糖蛋白D前体包膜蛋白并且短(QPELAPEDPED),所以它不太可能干扰蛋白质结构或功能。

MBP

      MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白大小为40kDa,由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性,尤其是真核蛋白。MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。如果蛋白在细菌中表达,MBP可以融合在蛋白的N端或C端。
纯化:融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效结合,而其他融合蛋白则不受影响。 缓冲条件为pH7.0到8.5,盐浓度可高达1M,但不能使用变性剂。如果要去除MBP融合部分,可用位点特异性蛋白酶切除。
检测:可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。

c-Myc

       C-Myc标签蛋白,是一个含11个氨基酸的小标签,标签序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu,这11个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。C-Myc tag已成功应用在 Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。

T7

       这是来自T7噬菌体的基因10产物的260个残基的标签; 可增强大肠杆菌中的表达水平。

Snap

       SNAP-Tag是从人的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移(O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase)获得。SNAP所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团,释放出了鸟嘌呤。这种新的硫醚键共价结合使SNAP所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物。生物素或各种颜色荧光的底物(如荧光素、若丹明)可渗透进入细胞,方便快捷地进行活细胞内SNAP-Tag融合蛋白的标记与检测,它也可特异性地标记大肠杆菌,酵母和哺乳动物等细胞抽提液或已经纯化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。

SV40 NLS

       核定位序列PKKKRKV或PKKKRKVG,分子量为883.13,野生型的氨基酸序列为Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val, 即使单个氨基酸突变所产生的突变型NLS(Pro-Lys-Tyr-Lys-Arg-Lys-Val)也能阻止这种蛋白质进入细胞核而停留在细胞质中。

P2A/T2A

       2A肽被发现于口蹄疫病毒(FMDV),是从其中鉴定出的一种“自裂解”小肽,其平均长度为18-22个氨基酸。2Apeptide“同时转录,同时翻译”。

IRES

       IRES元件具有不依赖帽子结构而独立募集核糖体的功能,进而可以启动下游基因的翻译。IRES“同时转录,独立翻译”。

V5

       来源于副粘病毒SV5的P / V蛋白的95-108位氨基酸(GKPIPNPLLGLDST),V5 标签常被融合表达于靶蛋白的 N 末端或者 C 末端,以便对靶蛋白进行分析和鉴定。

dTomato

       在所有光谱型中,亮度最强的荧光蛋白是串联形式的二聚体Tomato(dimeric Tomato, dTomato)。串联二聚体包含dTomato的2各拷贝,由12个氨基酸残基的接头链接。由于有一对发色团,导致dTomato亮度极强并且有得天独厚的光稳定性。dTomato最大的缺点是分子量较大,在某些情况下会干扰融合蛋白的折叠。

CAT

       氯霉素乙酰转移酶(CAT),这个24kDa大小的标签也用作报道基因,与大多数蛋白质融合时依然能保留其活性。这意味着它可以用来直接测量表达水平,而不需要PAGE或免疫检测。

DHFR

       二氢叶酸还原酶(DHFR),这个25kDa蛋白质参与胸苷生物合成途径。带有这个标签的蛋白质的纯化可以通过甲氨蝶呤连接的树脂实现。

mCitrine

       最早的变体EYFP虽然仍被广泛使用,但由于其pKa值高、对卤化物敏感,导致EYFP的应用还很不理想。单体形式的变体柠檬黄(mCitrine)和维纳斯(mVenus)是目前应用最多的黄色荧光蛋白。

mRuby2

       最亮的红色荧光蛋白。

Neo

       一般卡那霉素抗性基因编码的是新霉素磷酸转移酶II,基因记做neo,能通过降解G418、新霉素和卡那霉

素来实现真核和原核细胞的相应抗性,这个酶在基因工程中是比较特殊的,既可以在原核生物中表达使大

肠杆菌等表现出卡那霉素抗性,也可以在真核生物中表达使动植物细胞表现出G418抗性。

Puro

       嘌呤霉素(puromycin;PM ) 是一种蛋白质合成抑制剂,它具有与tRNA分子末端类似的结构,能够同氨基酸

结合,代替氨酰化的tRNA同核糖体的A位点结合,并掺入到生长的肽链中。虽然嘌呤霉素能够同A位点结

合,但是不能参与随后的任何反应, 因而导致蛋白质合成的终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟

的多肽,作用是抑制蛋白质合成的延长。

B42,GAL4,LexA,VP16

SUMO

       这些标签用于酵母双杂交系统中的蛋白质相互作用,可作为DNA结合(GAL4,LexA)结构域; 转录激活因子(B42,GAL4,VP16)

SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白(Small ubiquitin-likemodifier),是泛素(ubiquitin)类多肽链超家族的重要成员之一。在一级结构上,SUMO与泛素只有18%的同源性,然而两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。研究发现SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣,不但可以进一步提高融合蛋白的表达量,且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠,提高重组蛋白可溶性等功能。
此外SUMO还有一项重要的应用,就是可用于完整地切除标签蛋白,得到天然蛋白。因为SUMO蛋白水解酶(我公司可提供)能识别完整的SUMO标签蛋白序列,并能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来。切除SUMO后,经过亲和层析,去除标签蛋白部分,就得到和天然蛋白一样的重组蛋白。所以SUMO标签也常用于和其他标签一起应用,作为特异酶切水解位点。



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