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circRNA RIP实验
产品介绍
RNA免疫沉淀（RIP）运用针对目标蛋白质的抗体把相应的RNA-蛋白质复合物沉淀下来，经过分离纯化并对结合在复合物上的RNA进行测序或PCR分析。RIP可应用于研究miRNA调节靶点、RNA与RBP（RNA结合蛋白）的互作关系等。
RIP技术原理
客户提供
1. 新鲜细胞/组织样本（组织≥100mg，细胞不少于1E+7个），细胞须保证无支原体污染；
2. IP级别抗体和抗体信息；
3. qPCR检测基因信息：物种、基因名称、长度和序列等，指定具体转录本（例如NCBI编号NM_001126113.2）；
4. RIP产物的检测项目。
交付标准
1. RIP实验报告（方法、流程，结果）；
2. RIP剩余产物。
案例解析
RIP实验的目的是分析与目的蛋白结合的RNA，原理则是运用针对目的蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化并对结合在复合物上的RNA进行测序或PCR分析。
2016年9月23日，意大利Maria R. Matarazzo教授在Methods in Molecular Biology杂志介绍了RIP实验的经典操作方法。文中介绍的RIP实验操作流程如下图所示：
图1 经典RIP实验操作流程（来自[1]）
而RIP实验有哪些应用呢？大家都知道RNA是一种不稳定的生物大分子，绝大多数RNA都需要与特定的RNA结合蛋白形成RNA-蛋白复合物才能稳定存在于细胞中。RNA-蛋白复合物驱动了几乎所有细胞过程的基因表达的转录后调控，包括剪接（splicing）、出核转运（nuclear export）、mRNA稳定性以及蛋白转译过程。因此，对基因调控的了解就有赖于确定这些过程中RNA的结合的变化，RIP技术应运而生，可应用于研究miRNA调节靶点、RNA与RBP（RNA结合蛋白）的互作关系等。
案例1
RIP用于研究circRNA与蛋白互作
2022年3月29号，重庆医科大学的陈俊霞教授在Mol Cancer发表文章Hypoxia-induced circWSB1 promotes breast cancer progression through destabilizing p53 by interacting with USP10，本研究揭示了一种新的机制，即缺氧诱导的circWSB1可以与USP10相互作用，从而减弱USP10介导的p53稳定并促进BC的进展，为BC提供了一种替代的预后生物标记物和治疗靶点。
已有报道发现，环状RNA通过miRNA海绵机制参与缺氧的调控。几乎所有这些与缺氧相关的circRNA都起到了miRNA海绵的作用，环状RNA同样可以通过结合蛋白以及翻译多肽发挥功能。作者使用pull-down对环状RNA的结合产物进行分析，虽然没有发现P53，但是作者发现泛素化酶USP10与circWBS1相互结合。使用数据库对二者的结合位点进行了预测。设计USP10的全长和缺失突变体并插入Flag标签（图2），通过RIP实验（使用吉赛生物RIP试剂盒）对USP10与circWBS1的结合进行了验证。
案例2
RIP用于研究lncRNA与蛋白互作
图4 lncRNA和编码RNA与EZH2结合能力的比较（来自[3]）
在本研究中，使用EZH2特异性抗体对人胃癌细胞系MKN45和AGS，以及对照细胞系GES-1进行RIP-seq，分析了8256个与EZH2相关的RNAs，包括编码和非编码RNAs，其中MALAT1在MKN45细胞系中高表达。并且发现MALAT1通过和EZH2相互作用，抑制原钙黏蛋白因子10（PCDH10）的表达，从而促进胃癌细胞的侵袭和转移[3]。
案例3
RIP用于研究miRNA与蛋白互作
图5 缺铁性和非缺血性NPCs中isomiRs分析（来自[4]）
在本研究中，利用Ago2 RIP-seq，分析非缺血性和缺血性成年大鼠侧脑室下区（SVZ）的神经祖细胞（NPCs）miRNAs的表达情况[4]。
结果显示，相较于非缺血性NPCs，中风改变了NPCs中Ago2相关的miRNAs表达，缺血性NPCs中的isomiRsreads数增加，其中5'末端添加核苷酸的isomiR-142-5p_L+2R-1显著上调，5'末端缺失核苷酸的isomiR-187-5p_L-2R+3显著下调[4]。
参考文献
1. RIP: RNA Immunoprecipitation. Methods Mol Biol, 2016. 1480: p. 73-86.
2.Hypoxia-induced circWSB1 promotes breast cancer progression through destabilizing p53 by interacting with USP10[J]. Molecular Cancer, 2022, 21(1):1-20.
3. MALAT1 long ncRNA promotes gastric cancer metastasis by suppressing PCDH10.Oncotarget. 2016 Mar 15; 7(11): 12693–12703.
4. Identification of miRNomes associated with adult neurogenesis after stroke using Argonaute 2-based RNA sequencing.RNA Biol. 2017; 14(5): 488–499.
结果展示
以anti-SNRNP70为目的抗体，anti-IgG为对照抗体，在Hela细胞裂解样本中，进行免疫沉淀。免疫沉淀所得蛋白质样品，进行Western blot检测，input样本与目的样本在约70KDa大小位置有明显条带，阴性对照样本无条带。
免疫沉淀所得RNA逆转成cDNA后，以U1 snRNA特异性引物，进行qPCR分析，RIP组相对表达显著高于IgG组，指示SNRNP70富集U1 snRNA。
Western blot检测SNRNP70：
qPCR检测U1 snRNA：
常见问题
1. RIP送样里细胞需要量是1E7的细胞量，是必须要达到1✖10的7次方的细胞量吗？
我们推荐用7次方进行，这种内源结合本来就只能结合少量的蛋白和RNA，如果最开始的细胞量少，结合下来的物质可能会更少。
2.RIP实验产物能否进行去线性，进行circRNA建库？
如果客户RIP捕获前已经打断了RNA，这直接可以判断，不能去线性
如果捕获产物中RNA的片段化程度比较高，不建议用去线性的方法测circRNA。
一般RIP测序，都是建议用去rRNA链特异的方面进行建库测序。
3.RIP结果WB检测正常，Input、IP、Igg三组ct值几乎无差异说明什么？
说明目的蛋白与检测基因无特异性结合。
4.为什么RIP实验前要做WB预实验评估？
做WB预实验主要目的：
① 检测抗体的特异性，是否能结合目的蛋白；
② 检测样本中目的蛋白是否有表达及丰度水平；
③ 总之，检测该样本能否满足做RIP实验的最基本条件。
④ RIP预实验做的是WB检测，跟我们平常理解的预实验不太一样，这是探索性实验，预实验的目的是检测这个实验的基本条件。
5. 我的抗体做WB都有目的蛋白条带的，为啥做RIP就没条带了？
免疫试验有很多，但实验目的不一样，例如WB、ELISA、IP、IF、ChIP、IHC(P)、FACS，其中只有WB是一种需要将蛋白质变性的实验，用强烈的蛋白变性剂SDS和β巯基乙醇，将蛋白质的三维结构全部抹去，这种情况下任何一种该蛋白的抗体都能识别WB实验中变成直线状态的抗原；但能做WB的抗体就不一定能用来做非变性试验IP、IF、IHC了，因为天然蛋白的三维结构隐藏了很多抗体结合位点，WB级别的抗体无法与之结合。做RIP实验，需要选购IP级别的抗体。
6. 在RIP实验中，为什么IP和WB使用的抗体需要来源于不同的种属？
在RIP实验中，IP和WB使用的抗体需要来源于不同的种属，否者在跑WB时，会在55KD和25KD的位置出现较强的重链和轻链，影响目的蛋白的曝光。