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microRNA 靶基因验证实验

 

双荧光素酶报告基因实验：是将预测能够与miRNA结合的靶基因3’UTR序列插入载体中萤火虫荧光蛋白（firefly luciferase）的3’UTR区域。当miRNA和质粒中的插入序列结合后，miRNA会通过和所插入的序列结合从而抑制萤火虫荧光蛋白的翻译最终造成荧光值的下降。海肾素荧光蛋白（renilla luciferase）是作为内参来去除组间的转染效率差异。

miRNA的作用机制是与靶mRNA3‘UTR区结合 ：  1）降解mRNA从而蛋白水平下降    2）不降解mRNA但阻止翻译。后者的作用方式就好比在mRNA上粘了个阻遏物，翻译的时候就被中止了，wb验证蛋白水平有下降，但是qpcr检测mRNA水平依然不变。

实验流程：

1.microRNA靶点的预测：
利用Targetscan,miRanda等软件得到目的microRNA的预测靶点序列或者客户提供。

2.构建双荧光素酶载体：
根据提供的靶序列，合成两条互补的单链DNA模板。或者设计引物PCR扩增目的microRNA靶基因3’UTR序列，构建至双荧光素酶载体上。

同时构建结合位点突变的mut质粒作为对照组。

3.荧光素酶检测
将含目的microRNA靶基因的报告基因载体和microRNA　mimics或microRNAnegative control共转染293T或Hela细胞。共转染细胞24-72h后，进行双荧光素酶检测，即同时检测firefly luciferase和renillaluciferase活性，确定目的microRNA的靶基因。

常用的双荧光素酶的表达质粒psicheck2