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RNase R
RNase R是一种来源于大肠杆菌RNR超家族的3’-5’核糖核酸外切酶，可从3’-5’方向将RNA逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R可消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化环形RNA、套索结构或3’突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子。
RNase R是circRNA的鉴定和富集实验必备工具酶，可消化线性RNA以使环形RNA（circRNAs）或套索结构RNA（lariat RNA）得到富集。
图1.RNase R消化RNA示意图
应用场景
1. circRNA的鉴定
根据RNase R(+)和RNase R(-)组中是否检测到条带来证明检测的分子是否是circRNA。
图2.RNase R消化后RT-PCR检测Lariat/Circular RNA
在图2中，检测mRNA在RNase R(-)中有条带，在RNase R(+)中无条带；检测Lariat/Circular RNA，在RNase R(-)和RNase R(+)样品中都有条带，表明mRNA被消化，而Lariat/Circular RNA耐受消化（Suzuki H et al., 2006）。
2. circRNA的富集
高通量测序时常需要对circRNA进行富集，为探究RNase R消化后circRNA的富集程度和相关基因的变化，可以同时做RNase R(+)和RNase R(-)组样品的测序。
图3.RNase R(+)和RNase R(-) RNA测序示意图（Jeck WR et al., 2014）
有研究报道，测序显示RNase R(+)组中Junction Reads相对于RNase R(-)样本有5-10倍的富集，可鉴定出几千到上万个circRNAs（图3）。
3. circRNA的纯化
消除线性RNA残余的干扰，是人工合成高纯度circRNA的关键。高效的RNase R不仅是连接酶法circRNA人工合成的关键工具，在内含子自剪切的circRNA人工合成中也是必不可少的。
产品信息
名称 | 货号 | 规格 | 目录价（元） | 保存温度 |
GSPure®RNase R | R0301 | 500 U | 1180 | -20℃ |
R0302 | 5000 U | 询价 |
产品优势
特异性强：特异性消化线性RNA；
高效快速：5-15min即可消化大部分线性RNA；
Buffer兼容：消化产物可直接用于下游实验；
使用方便：体系简单，37℃一步反应。
质量控制
SDS-PAGE 检测纯度>95%；Total RNA经RNase R消化后进行RT-qPCR检测，线性 RNA丰度明显降低，环形RNA丰度基本不变。
性能比较
1. RNA电泳检测
将10U RNase R加入到2.5 μg Total RNA中，于37℃孵育15 min后直接进行电泳检测，结果显示RNase R(+)组条带变淡（不可见），表明RNase R对Total RNA产生消化作用。吉赛和公司A或公司E的RNase R对Total RNA消化效果相当。
2. RT-qPCR检测
将10U RNase R加入到2.5 μg total RNA中，于37℃孵育30 min后进行RT-qPCR实验，结果显示RNase R+组β-actin和FGFR2的丰度都明显降低，表明RNase R可消化线性RNA。吉赛和公司E的RNase R对线性RNA消化效果相当，优于公司A的RNase R。
将10U RNase R加入到2.5 μg total RNA中，于37℃孵育30 min后进行RT-qPCR实验，结果显示RNase R+ 组中hsa_circFOXO3_002和hsa_circMTO1_001的丰度基本不变，表明circRNA耐受RNase R的消化。吉赛和公司E或公司A的RNase R效果相当。
注：数据计算以“RNase R+吉赛”组为对照，设定其相对丰度值为1。
Q&A
1.RNase R消化成功的标准？
建议RNA经RNase R消化后取一部分直接进行电泳检测，28、18S条带变淡说明消化成功。（电泳结果比较直接，可观测到消化成功，若不成功就是有问题）
2.RNase R实验怎样设计对照组？
参考下图多几个分组和对照，排除下影响因素。（增加多个对照，可以排除和找出异常情况的原因）
3.RNase R实验的条件？
消化时间和RNase R用量可能需要预实验摸索，找到合适的条件，让线性RNA被消化而 circRNA保持不变。一般37℃消化15min，检测内参的Ct值延后5~10都是比较成功的结果。（考虑消化不够或过头，或者结果数值不好看，可以做预实验摸索）
4.RNase R引物检测的问题？
注意检测引物的特异性问题。注意区分circRNA和mRNA的同源序列。（引物有非特异扩增的时候，检测结果数值完全不可能，任何说消化无效果或效果过头都不可信）
5.CircRNA数量不变，算成功吗？
总RNA被消化后，线性RNA数量减少，circRNA数量基本不变，则其中circRNA的比例增加了，即circRNA被富集了，后面qPCR检测circRNA的丰度有可能会偏高，是正常的。
6. RNase R消化后如何回收RNA？
RNase R消化后消化液如果回收，图方便可以使用Trizol回收，按说明书操作即可。如果不回收直接进行逆转录的，吸取消化液的体积不能超过逆转录体系的1/4，因为消化液中残留的离子等会干扰下游的RT-qPCR反应。例如逆转录是20ul体系，则吸取的RNase R消化液不能超过5ul。
7.RNase R消化不成功怎么办？
使用新的试剂盒或试剂重新提取RNA，保证RNA的纯度和质量。（RNA的纯度高才能消化效率高，酚类等残留会明显影响消化效果，gDNA污染也会减弱消化效果）
8. RNase R如何储存
当天内使用的，RNase R（20U/ul）可以用无酶水稀释，长期使用的，应该用Storage Buffer稀释，配方在说明书里有。(用量少时体积小，有客户想稀释使用)
9.RNase R消化有什么注意事项
配置Nuclease-free的试剂，需要使用Nuclease-free的水、吸头等试剂耗材，或者用DEPC处理过的水，另外实验台面（建议全程超净台内或生物安全柜内）也要用核酸酶清除剂喷雾和擦拭处理，这些都是做RNA实验的配置。
10.RNase R消化的特殊情况
特殊情况：有的线性RNA耐受消化，有的circRNA也容易被消化。
11.RNase R消化后不用纯化，直接跑胶，是否可以？
可以的。还能评估下消化效果，28、18S条带变淡说明消化成功。
另，直接进行RT-PCR的，一般也可以不做纯化，酶失活后直接进行逆转录反应即可。
12.消化反应中RNase R使用多少比较合适？
不同参考文章里RNase R的使用量和反应体系都有差别，最常见的是20 μL反应体系，使用比例为1-4 U RNase R/μg RNA，实验中可能需要摸索调整。
13.RNase R消化反应温度和时间设定多少？
RNase R消化一般于37℃进行反应，一般10-30 min即可消化掉大部分线性 RNA。常用5-15 min消化就能得到很好的结果。
14.RNase R消化反应后要不要灭活？
经RNase R消化后直接进行逆转录反应的，推荐在37℃反应结束后保持70℃ 10 min使RNase R灭活（也有65℃ 15min）。如果消化后要进行纯化回收，也可以不做灭活。
15.RNase R消化鉴定
样本RNase R消化前后取一部分直接进行电泳检测，可直观查看抽提的RNA质量及Rnase R消化效果，28、18S条带变淡说明消化成功。若RNA纯度不高，28S/18S条带可能有凹型拖尾。若RNA有gDNA污染，可能残留gDNA条带。
16.RNase R消化反应条件？
不同的circRNA对RNase R的耐受性不同，具体反应时间需要自行摸索。一般反应时间为10-30 min，不推荐过长时间的消化。个别circRNA耐受RNase R消化力弱。对此，可以减少消化时间。
17.RNase R消化后需要测定产物浓度吗？
不可直接测定RNA浓度，因为反应体系内的蛋白质、盐离子等成分会导致RNA浓度测定不准确。建议先纯化RNA再测定浓度。
18.RNase R消化后产物处理：
直接进行逆转录反应的，推荐RNase R灭活。灭活条件为：70℃保持15min。吸取消化液的体积不能超过逆转录体系的1/4，因为消化液中残留的离子等会干扰下游的RT-qPCR反应。例如逆转录是20ul体系，则吸取的RNase R消化液不能超过5ul。
如果消化后要进行纯化回收，也可以不做酶的失活。、
点击 说明书下载：GSPure®RNase R Cat.No.R0301 R0302.pdf
案例1：
2022年7月21日，西北大学生命科学学院关锋教授团队在C1GALT1在膀胱癌中的生物功能及其调控机制的研究中取得了新进展，研究结果发表在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research，题名“Dysregulation and prometastatic function of glycosyltransferase C1GALT1 modulated by cHP1BP3/ miR-1-3p axis in bladder cancer”。
研究团结队使用RNase R（R0301，吉赛生物）检测了7个DEcircRs对RNase R消化的敏感性，以排除可能通过反式剪接、基因组重排或PCR产物产生的头尾剪接。证明DEcircRs对RNase R的抗性均高于GAPDH对照。
案例2：
2022年8月12日，北京大学基础医学院张卫光教授团队在Redox Biology杂志在线发表了题为“CircSV2b participates in oxidative stress regulation through miR-5107-5p-Foxk1-Akt1 axis in Parkinson's disease”的研究论文。该研究发现circRNA分子 circSV2b在帕金森病（Parkinson's disease，PD）发病过程中发挥着重要作用，并揭示了其作用机制。
研究团结队使用RNase R（R0301，吉赛生物）处理显著降低线性SV2b和β-Actin的mRNA水平，而circSV2b的量未观察到明显的改变，证明circSV2b是一个高度稳定且内含子保留的环状RNA。
客户文章
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[3] IF15.302 Circular RNA circCORO1C promotes laryngeal squamous cell carcinoma progression by modulating the let-7c-5p/PBX3 axis. Molecular Cancer
[4] IF13.493 The circFASN/miR-33a pathway participates in tacrolimus-induced dysregulation of hepatic triglyceride homeostasis. Signal Transduction and Targeted Therapy
[5] IF12.658 Dysregulation and prometastatic function of glycosyltransferase C1GALT1 modulated by cHP1BP3/ miR-1-3p axis in bladder cancer. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH
[6] IF11.556 Engineering circular RNA regulators to specifically promote circular RNA production. Theranostics
[7] IF11.492 CircIMMP2L promotes esophageal squamous cell carcinoma malignant progression via CtBP1 nuclear retention dependent epigenetic modification. Clinical and Translational Medicine
[8] IF11.161 Circular RNA circ-MTHFD1L induces HR repair to promote gemcitabine resistance via the miR-615-3p/RPN6 axis in pancreatic ductal adenocarcinoma. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH
[9] IF11.161 Warburg effect-promoted exosomal circ_0072083 releasing up-regulates NANGO expression through multiple pathways and enhances temozolomide resistance in glioma. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH
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[12] IF10.392 A novel intronic circular RNA, circGNG7, inhibits head and neck squamous cell carcinoma progression by blocking the phosphorylation of heat shock protein 27 at Ser78 and Ser82. Cancer Communications
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