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解剖式学习一个质粒结构(引自作者微基生物 )
一、实验流程介绍
天然的CRISPR-Cas9系统由三部分组成：SpCas9 (简称Cas9)、crRNA、tracrRNA。tracrRNA（在CRISPR-Cas9编辑技术中被优化并命名为gRNA scaffold），它负责与Cas9结合，与重复序列具有同源性。crRNA为引导序列，约20个碱基，具有特异性。其中，crRNA和tracrRNA通过局部碱基配对组合并与Cas9结合后，引导Cas9识别切割目标DNA序列 (图1)。为了方便实验设计以及提高gRNA的稳定性，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier将crRNA和tracrRNA融合成一条RNA链条，并把其称为sgRNA (single-guide RNA)。与 CRISPR-Cas9 系统不同的是 在CRISPR-Cas12a 系统中，Cas12a不需要tracrRNA，并且产生的断链为粘性切割，并识别富含T的PAM。在个别菌株编辑实验中，Cas12a比Cas9表现出较高的编辑效率，如谷氨酸棒杆菌，梭状芽孢杆菌。
1. 目标菌株检测及培养
扩培目标菌株，耐药测试以确保菌株不携带用来进行阳性克隆筛选的抗性基因，目标基因测序即确定靶基因序列
2. gRNA序列筛选
根据脱靶效应得分和靶向活性参数，选择至少2个，理论上编辑效率较高 gRNA序列，通常约20个碱基。目前已有许多在线的gRNA 设计软件可用于计算gRNA的参数。
3. 确定同源修复模板长度和序列
同源臂的长度会影响DNA断链的修复效率，选择模版是最好与切割点控制在10 bp以内。在细菌中，常用的同源臂长度一般在50 – 80个碱基。
4. 非模式菌株启动子、复制起点筛选、合成
在模式菌株中（如大肠杆菌，芽孢杆菌）的基因编辑技术相对成熟，因此也较为容易的可以失实现较高的编辑效率。由于在不同的菌株对启动子和质粒复制起点存在一定的偏好，因此适用于大肠杆菌的启动子很可能不适用于其他非模式菌株。对非模式菌株进行基因编辑，则需要筛选出能在该菌株中正常表达的启动子及与该菌株兼容的质粒复制起点，以确保靶向质粒可以有效地在目标菌株中复制和转录外源基因。此筛选步骤是实现在非模式菌株中进行编辑的关键流程。
5. 质粒转化验证与优化
质粒转化通常可通过两种方式实现，分别为电转和接合。通过电转进行质粒转化则需要制备目标菌株的感受态细胞，如何制备非模式菌株的感受态及电转条件摸索是实现高效率转化的关键步骤。接合的方式一般是通过携带打靶质粒的大肠杆菌（如S17）接合至目标菌株，然后进行阳性克隆筛选。接合比电转的实验流程较为复杂和耗时，但是可以省去在非模式菌株中的前期条件摸索步骤。
6. 构建打靶质粒
目前较为流行的构建方法为无缝克隆（Gibson assembly），此方法的优势是可同时实现多个DNA片段的顺序拼接克隆。
7. 打靶，阳性克隆筛选，质粒清除，测序验证
将打靶质粒导入目标菌株后，进行阳性克隆筛选，通用的筛选方式是抗性筛选。常用的质粒清除方式是让目标菌株在无抗生素的培养液中生长，稀释传代数次，获得最终编辑后的菌株。也可以使用温度敏感性的质粒复制起点。为了进一步验证实验结果，我们需将编辑后的菌株进行靶基因序列验证。如靶向编辑的是功能性基因，可进行后续功能性缺失研究，靶向代谢物分析等。
8. 菌株冻存，结果及实验报告交付
-80°C 冻存菌株，交付实验报告其包括实验流程，靶向质粒图谱，测序结果等
二、术语表
| 名词 | 描述 |
| CRISPR – Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats | 规律成簇间隔短回文重复，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。 |
| Cas | CRISPR相关蛋白，包括Cas9和Cas12a等核酸酶(也称为Cpf1) |
| CRISPRa – CRISPR activation | CRISPR激活；使用具有gRNA效应的dCas9或dCas 9-激活剂以增加靶基因的转录 |
| CRISPRi – CRISPR interference | CRISPR干扰；使用具有gRNA的dCas9或dCas9阻遏物来抑制/降低靶基因的转录 |
| dCas9 – “Dead” Cas9 | dCas9 包含两个突变，使得 Cas9 的切割活性完全消失。这种 Cas 蛋白可以用于基因沉默（CRISPRi）和基因激活（CRISPRa）。 |
| DSB – Double Strand Break | 双链断裂，即DNA 双链条的断裂 |
| gRNA – guide RNA | 导向RNA，一种crRNA和tracrRNA的融合，为Cas9提供靶向特异性和支架及结合能力。这种合成融合体在自然界中并不存在，通常也被称为sgRNA。 |
| gRNA scaffold | gRNA中负责Cas9结合的序列， 扮演着tracrRNA的作用。不包括用于引导Cas9靶向DNA的20 bp间隔区/靶向序列。 |
| gRNA targeting sequence | gRNA靶向序列，即PAM序列之前的20个碱基，扮演着crRNA的作用。该序列被克隆到gRNA表达质粒中，但不包括PAM序列或gRNA scaffold序列 |
| HDR – Homology Directed Repair | 同源定向修复，在导入 CRISPR 组分的同时还需要导入一段带有我们想要敲入的序列的外源 DNA，同时需要有对应的同源臂。细胞会利用这段外源 DNA 来同源重组，进而修复 CRISPR 系统导致的 DNA 双链断裂。这一过程中将会发生外源 DNA 序列的敲入。 |
| Indel | 插入/缺失碱基，这是一种突变类型，可通过转移ORF和/或产生过早的终止密码子从而导致基因中断。 |
| NHEJ – Non-Homologous End Joining | NHEJ 可以将 DNA 末端重新连接在一起，但这个过程中容易产生错误，并很产生Indels，即随机地插入或删除碱基。 |
| Nick | DNA 缺口, 仅在DNA双链条中产生一处断裂 |
| Nickase | 切刻酶，可产生缺口的酶，这里指在两个核酸酶结构域中其中一个被失活的Cas9。这种酶只能切割双链DNA中的一条链。 |
| Off-Target Score | 脱靶效应得分，该指标可预估出 gRNA 会和非目标位点结合的可能性。 |
| On-Target Score | gRNA活性得分，即Cas9在由gRNA靶序列指定的所需位置进行切割。 |
| PAM - Protospacer Adjacent Motif | 原间隔基邻近基序，协助gRNA 与基因组目标位点的结合。PAM 序列所在的 DNA 单链与 gRNA 所结合的 DNA 单链是两条不同的链。最常用的 Cas9 识别的 PAM 序列是 5'-NGG-3'，其中 N 代表任意碱基，Cas12a 识别的常用 PAM 序列是 5'-TTTV-3'，其中 V 代表A/G/C. |
