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circRNA过表达实验
产品介绍
自2015年推出circRNA过表达载体以来，吉赛生物持续优化不断开发，目前已将载体产品全面升级为第五代。
第五代circRNA过表达载体有pCD5-ciR、pCD25-ciR、pLO5-ciR、pLC5-ciR、pK5ssAAV-ciR和pK25ssAAV-ciR，能满足普通真核表达、慢病毒包装和腺相关病毒（AAV）包装等多种用途。载体均携带优化过的侧翼成环框架，含有精心改造的Alu元件、QKI等RBP的结合位点，并使用全新设计的环化介导序列，使插入的circRNA准确高效环化。
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过表达载体图谱
技术优势
1. 过表达效率高：显著过表达50倍以上，最高可达上万倍；
2. 序列环化准确：有效保证目标circRNA的线性序列准确环化，无碱基添加或缺失；
3. 稳定性高：200nt~2000nt序列均能实现准确高效过表达；
4. 适用范围广：可用于细胞瞬时转染、包装慢病毒或腺相关病毒，同时可提供GFP绿色荧光蛋白标记和嘌呤霉素抗性基因标记，适用不同实验需求。
项目明细
1. 载体构建；
2. 瞬时转染（人293T细胞验证）；
3. 引物设计合成；
4. qPCR验证（三次重复含内参）；
5. Sanger测序验证。
客户提供
1. circRNA名称（ID）、长度、序列、物种；
2. 指定载体名称。
交付标准
1. 过表达质粒：10 μg质粒+200 μL甘油菌；
2. 对照质粒：10 μg质粒+200 μL甘油菌；
3. 载体构建与验证实验报告：
①载体构建步骤；
②载体测序验证结果原始文件；
③细胞转染实验步骤；
④qPCR检测原始数据及qPCR产物测序原始文件；
⑤qPCR检测实验步骤；
⑥载体构建与验证实验报告。
案例解析
2020年9月14日，中山大学孙逸仙纪念医院苏士成教授合作团队在Cell杂志（IF 41.584)上发表了题为Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output的文章，该文章应用Arraystar Human CircRNA芯片筛选鉴定出与非酒精性脂肪性肝炎发生相关的环状RNA分子SCAR，并发现在线粒体中过表达circRNA SCAR能够抑制肝脏成纤维细胞的活化与相应的炎症反应，敲低则有相反的表型。并且作者使用吉赛公司过表达载体 pcD-ciR 通过插入3×flag标签以及预测的ORF序列（图1），发现circRNA SCAR无法编码蛋白质，随后作者通过一系列实验发现该circRNA能够直接与ATP5B结合并发挥生物学功能[1]。作者团队发现了线粒体circRNA的重要功能并发展了一系列相关的实验方法，为免疫代谢疾病提供了一种有吸引力的治疗策略。
参考文献：
Qiyi Zhao, Jiayu Liu, Hong Deng, et al. Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output.Cell (2020), https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.009
结果展示
qRT-PCR检测：
表1 hsa_circ_00AAAAA的相对表达差异
Sample name | GAPDH Average CT | has_circ_00AAAAA Average CT | 2-ΔΔCT1 | 2-ΔΔCT2 | 2-ΔΔCT3 | Average 2-ΔΔCT±SD | SEM |
293T-control | 19.25±0.26 | 29.6±0.36 | 0.76 | 1.24 | 1.06 | 1±0.24 | 0.14 |
293T-pLC5-ciR | 18.7±0.27 | 29.56±0.13 | 0.68 | 0.78 | 0.66 | 0.71±0.07 | 0.04 |
293T-CAAAAA | 18.96±0.24 | 20.13±0.08 | 608.27 | 548.02 | 594.46 | 583±31.57 | 18.22 |
图1 hsa_circ_00AAAAA的相对表达量
qPCR产物测序结果：
注：hsa_circ_00AAAAA在circBase中的环化位点序列GATTATGGAAACAGCTTTTTATAACTATGATG
结论：
相比于对照组，CAAAAA组的过表达倍数为***；PCR产物测序峰图正常，无杂峰或叠带，序列与环化位点参考序列对比吻合。以上结果表明CAAAAA能在真核细胞中成功过表达目的hsa_circ_00AAAAA。
常见问题
1. circRNA过表达怎么做？
CircRNA的形成和线性RNA不同，因此对circRNA的过表达不能直接将序列连接到常规的真核表达载体（如pcDNA3.1）来进行。已明确的circRNA形成依赖于侧翼序列中的反向互补序列（RCMs，如Alu元件）或与能调控circRNA生成的蛋白（如QKI）的结合位点，因此构建载体时可以在circRNA序列上下游分别增加一段反向互补的序列，质粒转染细胞后会先转录出上游+circRNA+下游的线性RNA链，再依靠长下游的反向互补配对促使成环。
2. circRNA过表达成功标准？
载体构建好后瞬时转染细胞进行RT-PCR检测以验证过表达效率。
1）qPCR检测有过表达倍数，质粒瞬转效率高，基因本底丰度不太高的话一般都可以过表达50倍以上；
2）使用Divergent引物检测过表达的PCR产物是大小正确的单一条带，PCR产物进行sanger测序确定成环序列准确。满足这两个条件才可以认为载体实现了对circRNA的准确高效率过表达。
