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circRNA pull-down实验
产品介绍
RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。目前常用的两类技术，线性RNA替代法与探针钓取法，对同源性较高或表达丰度较低的circRNA并不适用。吉赛生物新一代circRNA pull-down技术，可对大部分circRNA实现高效率、强特异性的捕获。
circRNA pull-down技术原理
实验流程
circRNA pull-down实验流程
实验分组
circRNA pull-down实验分组
技术优势
1. 实验体系捕获的是环形的circRNA分子，相对“线性RNA替代法”可信度更高；
2. 通过circRNA过表达载体引入外源标签，可降低来源基因的背景干扰；
3. circRNA标签与捕获蛋白间的相互作用远远强于探针分子的捕获作用，特异性更高；
4. circRNA标签的插入位置可灵活设计，能有效避免竞争性探针导致的junction位置互作分子信息丢失问题；
5. 不依赖于细胞内本底表达的circRNA量，对细胞内表达丰度低的circRNA同样适用。
客户提供
1. circRNA名称（ID）、长度、序列、物种；
2. 指定载体名称；
3. 实验目的；
4. 预测结合位点信息；
5. 细胞和细胞相关信息。
交付标准
1. 详细的circRNA pull-down完整实验报告（包含载体构建、诱导表达、pull-down富集等）；
2. 带标签过表达质粒、不带标签过表达质粒、对照质粒（赠送）等；
3. 额外赠送（以下情况任选一）：
① 质谱检测2个样本；
② pulldown产物2个以内WB检测；
③ pulldown产物3个以内miRNA qPCR检测。
案例解析
1、circRNA pull-down技术在circRNA与蛋白间相互作用研究中的应用
在2016年Nature Communication杂志上发表了一篇关于circANRIL在动脉粥样硬化这一疾病中功能研究的文章中[1]，作者使用了RNA标签BoxB对circANRIL进行了标记，在工具细胞293T中进行pull-down实验。
作者对pull-down获得的蛋白进行质谱分析，结果显示，circANRIL结合蛋白中有38%与核糖体的形成有关，16%的蛋白参与了细胞内RNA的剪切调控[1] 。
这一结果为作者的后续研究提供了重要的指示，预测circANRIL与核糖体RNA形成可能存在密切关系，同时也是一个强有力的证据。
circANRIL pull-down获得的蛋白质谱分析[1]
2、circRNA pull-down技术在circRNA与miRNA间相互作用研究中的应用
2017年Journal of Experimental & Clinical Cancer Research杂志上发表的文章中，作者使用了MS2序列作为circRNA标签，在不同的乳腺癌肿瘤细胞中研究circRNA sponge功能。
作者在circGFRA1中引入了MS2序列标签，分别在MDA-MB-231、MDA-MB-486和BT549 这3株三阴性乳腺癌细胞中进行了pull-down，对circGFRA1进行富集，发现在circGFRA1富集产物中miR-34a也存在明显的富集情况[2]。随后一系列的实验结果证明，circGFRA1通过吸附miR-34a对其下游基因的表达进行调控，从而实现对肿瘤细胞增殖的促进作用。
circGFRA1富集产物中与miR-34a也存在明显的富集情况[2]
参考文献
1. Holdt, L.M., et al., Circular non-coding RNA ANRIL modulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans. Nat Commun, 2016. 7; 12429.
2. He, R., et al., circGFRA1 and GFRA1 act as ceRNAs in triple negative breast cancer by regulating miR-34a. J Exp Clin Cancer Res, 2017.10;36(1): 145.
3. Jian X, He H, Zhu J, et al. Hsa_circ_001680 affects the proliferation and migration of CRC and mediates its chemoresistance by regulating BMI1 through miR-340. Mol Cancer. 2020 01;19(1):20.
结果展示
通过pull-down实验将MS2-CP-MS2-circRNA复合物拉下来，WB检测MS2-CP蛋白，RT-qPCR检测目的circRNA的富集程度。
pull-down样品分组
分组 | pull-down抗体 | Input 样品 | 样品编号 | 描述 |
pull-down组 | anti-flag | CAAAAA-MS2+MS2-CP | 5 | 目的circRNA富集产物组 |
CAAAAA+MS2-CP | 6 | 无捕获标签对照产物组 | ||
CAAAAA-MS2+NC | 7 | 无捕获蛋白对照产物组 | ||
CAAAAA+NC | 8 | 无捕获标签、蛋白对照产物组 | ||
IgG | CAAAAA-MS2+MS2-CP | IgG | 阴性对照组 |
WB检测结果
图1 pull-down 前后样本WB检测结果（Flag抗体）
1~8组分别对应pull-down实验分组样品编号
RT-qPCR验证pull-down富集效果
qPCR产物检测hsa_circ_00AAAAA富集倍数
Sample name | hsa_circ_00AAAAA Average CT (Input) | hsa_circ_00AAAAA Average CT (pull-down) | 2-ΔΔCT1 | 2-ΔΔCT2 | 2-ΔΔCT3 | Average 2-ΔΔCT±SD | SEM |
6 | 21.7±0 | 24.5±0 | 1 | 1 | 1 | 1±0 | 0 |
7 | 21.4±0 | 23.89±0 | 1.24 | 1.24 | 1.24 | 1.24±0 | 0 |
8 | 22.19±0 | 24.85±0 | 1.1 | 1.1 | 1.1 | 1.1±0 | 0 |
IgG | 23.3±0 | 25.19±0 | 1.88 | 1.88 | 1.88 | 1.88±0 | 0 |
5 | 23.3±0 | 18.62±0 | 178.53 | 178.53 | 178.53 | 178.53±0 | 0 |
图2 pull-down产物检测hsa_circ_00AAAAA富集倍数
1~8组分别对应pull-down实验分组样品编号