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miRNA sponege 构建

 

miRNA  sponge

相对于常规基因来讲miRNA的功能丧失(loss-of-function)研究是难题,常用的RNAi技术在这里却不好用。成熟的miRNA与siRNA不相容,因为它们两者都能进入RISC复合物;pre-miRNA是茎环结构的,siRNA无从下手;pri-miRNA貌似是siRNA最容易靶定的,但一个是细胞核,一个在细胞质。

2007年,麻省理工大学的Phillip Sharp及他的同事,开发出一种长期抑miRNA基因的高效方法,他们称之为miRNA海绵(miRNA sponge)。miRNA海绵是一条mRNA,其3’非翻译区(UTR)包含若干个miRNA靶定位点(如下图)。更重要的是,这些靶定位点在RISC切割位点有一些错配。这样,抑制剂mRNA就不会被降解,而与RISC复合物稳定结合,让它远离天然的mRNA靶点。

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经研究证实,这些miRNA海绵是高效的miRNA抑制剂,其效力与反义寡核苷酸相当。由于miRNA与靶点的相互作用是依赖种子区域(seed region,miRNA的第2-8位),这样miRNA海绵对家族中亲缘关系接近的所有miRNA都有效,即特异性不高,这也有利有弊。制备某个家族缺陷的转基因小鼠变得相当容易。但如果你想要了解某个miRNA的特定功能,那就得将与之接近的miRNA全部去除。

 

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作者做了这样的验证实验:将miR-20和miR-21结合的位点构建到荧光素酶载体上,和miR-sponge表达质粒共转hela细胞,结果显示转染miR-sponge组的荧光素酶表达明显高于对照组。

 

miRNA海绵的应用很广。它可用于靶点预测的验证,也能分析miRNA的功能丧失表型。由于miRNA海绵是由表达质粒编码的,那么它也很容易推广到其它形式,譬如慢病毒、腺病毒或转基因,适合各种不同的细胞类型。Sharp还在研究中证实,在UTR上多加几个miRNA结合位点,能增加反义序列的量,从而提高海绵的效力。从原理上来说,miRNA海绵的CMV启动子也可以换成其它组织特异的启动子,让它们在果蝇、植物等模式生物中起作用。

我司常用miRNAsponge慢病毒表达载体如下:

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参考文献:
1. Margaret S Ebert, et al. MicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature Methods 4, 721 - 726 (2007)

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