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IRES 与 2A peptide在同时表达多个目标基因中的应用比较

         为了研究单个基因的功能机制或实现多基因协同表达, 那这种同时表达多个目标基因该如何实现呢？

  实际上，目前广泛采用多顺反子表达方案,即利用内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)或自剪切多肽2A(self-cleaving 2A peptide,2A)等元件来连接多个基因,实现在单个载体上表达多个多顺反子的目的。

   那么，IRES和2A peptide各有何特点呢？今天我们就来总结一下，让我慢慢道来~
 

IRES
 

     首先，人们发现，虽然一般真核mRNA的翻译都需要5’帽子来介导核糖体结合，但真核生物和病毒中还存在一些例外情况，例如一些基因5端具有一段较短的RNA序列（约150-250bp），这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体RNA结合，起始蛋白质翻译，这段非翻译RNA被称为内部核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site, IRES）。

   IRES元件具有不依赖帽子结构而独立募集核糖体的功能,进而可以启动下游基因的翻译。眼前一亮有没有？ 人们可以利用这个元件进行多顺反子的共表达。

Figure 1.A diagram of the Dicistroviridae RNA genome. Dicistroviruses are naturally dicistronic with two open reading frames that are translated by independent IRESs. The non-structural proteins are translated by the 5＇IRES whereas the structural proteins are translated by the IGR IRES. A genome-linked viral protein (Vpg) and the poly(A) tail (An ) are indicated[1].

   内部核糖体进入位点（IRES）是天然存在于一系列mRNA中的翻译增强子，当存在于目的基因之间时介导翻译的内部起始（图2）。因此，IRES可以通过设计类似于细菌操纵子的多顺反子表达盒，驱动由相同mRNA编码的几个基因的翻译。

    处在IRES元件前后的两个基因相对独立,可以表达得到完整的目的蛋白。但由于IRES的结构较大,其应用常受到载体容量的限制,并且IRES对位于其后的基因翻译起始能力相对较弱。

Figure 2. Cap-dependent and internal ribosome entry site-dependent initiation, two alternative mechanisms of translation. A: The so-called cap-dependent ribosome scanning mechanism predicts that ribosome 40S subunit binds to the mRNA 5’ end. Ribosome binding requires the initiation factor 4F (eIF-4F, composed of the three proteins eIF-4E, -4A and -4G). Then the mRNA is unwound under the control of the helicases eIF-4A and -4B, allowing the ribosome to scan the mRNA until recognition of an initiation codon (classically AUG); B: When an Internal ribosome entry site (IRES) is present in the mRNA 5’ untranslated region, IRES trans-acting factors (ITAFs) allow ribosome 40S internal recruitment, independently of the presence of cap and eIF-4F. The IRES-dependent mechanism occurs in the case of picornavirus uncapped mRNAs as well as for cellular capped mRNAs[2].
 

2A peptide
 

   但是如上所述，IRES有共表达两种基因表达量不均衡的问题，要解决这个问题，自剪切2A肽的构建策略近年来越来越收到了广泛关注。

   2A肽被发现于口蹄疫病毒（FMDV），是从其中鉴定出的一种“自裂解”小肽，其平均长度为18-22个氨基酸。最初，人们推测病毒编码蛋白或宿主细胞蛋白可能无法被切割。然而，该受体介导了在C-末端2A肽上合成异戊酰基脯氨酸肽的三聚体，导致2A肽之间立即被切割，下游肽具有脯氨酸N-末端(图3)。

Figure 3. Schematic representation of cleavage occurring in a peptide translated in foot-and-mouth disease virus (FMDV). 1D, 2A and 2B indicate contiguous endogenous peptides translated in FMDV. The arrowhead indicates cleavage site[3].

    2A元件在翻译过程中形成的高级结构对核糖体肽基转移酶中心造成空间位阻,导致无法形成正常的肽链连接,但同时核糖体却能继续翻译下游蛋白,从而形成一种类似蛋白水解酶的作用将前后两个蛋白顺式“切开”。

     2A 肽结构短小并且上下游基因的表达平衡性好。但由于其独特的“剪切”机制,导致最终分别得到一个融合有2A肽尾巴的上游蛋白和一个N端带有一个脯氨酸的下游蛋白,额外增加的2A肽结构可能会对目的蛋白的功能造成一定的影响。

Figure 4.(A)Two individual polypeptides can be generated from one transcript using 2A to link the individual genes. (B) 2A peptide sequence and its cleavage site(G/P)[4]

  综上所述，IRES“同时转录，独立翻译”，2A peptide“同时转录，同时翻译”，两者都用于多蛋白同时表达。但由于IRES和2A peptide两者各自存在的优缺点,在体外实验中人们通常需要构建两种或多种不同的表达载体来进行比较,才能找到最合适的表达方案。

  如果您有什么问题、意见或建议，也欢迎讨论哦！

参考文献:

[1]Tricks an IRES uses to enslave ribosomes.

[2]Internal ribosome entry site-based vectors for combined gene therapy.

[3]High Cleavage Efficiency of a 2A Peptide Derived from Porcine Teschovirus-1 in Human Cell Lines, Zebrafish and Mice.

[4]Use of the Foot-and-Mouth Disease Virus 2A Peptide Co-Expression System to Study Intracellular Protein Trafficking in Arabidopsis

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