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我们都知道一个基因（一个基因ID）往往可以编码多个转录本（多个NM号），相应的也对应多个蛋白质（多个NP号）。一条mRNA上编码蛋白质的区域称为CDS（coding sequence）。一个基因产生的多个mRNA往往有部分区域是重叠的（图4a红框内的区域），这部分重叠的区域叫做保守的CDS（consensusCDS），简称CCDS。我们通过基因组编辑破坏一个基因，往往需要破坏所有的mRNA编码的蛋白，因此，我们选择编辑的位点通常位于CCDS区域的上游位置（靠近起始密码子ATG的位置）。编辑的目的是在CDS区域随机引入碱基的缺失或插入（indels），如此可以破坏三联密码子的阅读框，产生移码突变(图4b)。
CCDS和移码突变示意图。a，方框代表外显子组织情况，黑色方框代表CDS区，红色框内是该基因对应的CCDS；b，移码突变。一个T碱基的插入改变了阅读框，最终导致终止密码子的提前出现，蛋白质翻译提前终止。移码突变往往导致蛋白质功能丧失。
SgRNA设计的站点介绍如下：
一、首先着重介绍几个在线设计gRNA的工具
着重推荐Lei Stanley Qi Lab的http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp
这个在线站点功能非常丰富，可以选择基因编辑工具的其他用途（激活，抑制基因表达等）（图1-1）。下一步就是选择物种（图1-2）。但只有常见的9种。再下一步就是直接输入基因的名称（或序列）即可（图1-3）。
图1-1 选择编辑类型
图1-2 选择物种
图1-3 选择基因名称。
但是出来的sgRNA位置有一些并不总在ATG的下游（图2所示，1，2，6，9，12，16，22几条sgRNA位于ATG的上游）。所以根据位置，对于做基因的敲除（KO）而言，强烈建议选择ATG下游通常100 aa以内范围内的sgRNA来用（比如图3中的3，5，7，10等较下游的）；而且，一定要位于CCDS区域内（CCDS是consensus CDS，即公共的CDS区域，是针对很多个转录本[isoforms]定义，图2中路色条框即是。这个很重要！！！）。
图2
● Feng Zhang lab：http://crispr.mit.edu/
这是最早的一个设计站点。包括常见的16个物种。选中物种，把你要设计的区段序列扔到下面的框里运行就行。。但前提是你自己已经选好了位置（图3）
图3
还有其他，如omictools下面的Cas-Designer
这个站点内容更加丰富，比如物种覆盖式最多的，包括植物，昆虫等等（图4左）。这个站点也是输入目的基因的序列定制的，不同的是可以有较大的自由度选择位置预测。
图4
还有一些商业公司的，比如Thermo下面的（图5）：
物种较少，商业性目的特别强，了解下即可。
图5
其实你只要google一下会发现特别多的设计工具，感兴趣的可以自行探索。
图6
二、手动版设计方法—好用不贵
手动版本虽然费事，但有时候却会事半功倍，节约后续鉴定单克隆的成本。我们举例来说：
图7
序列中PAM和sgRNA的序列放大如下（前提是sgRNA位于CCDS区域，而且特异性要保证）：
图8
也即我常说的，让Cas9切割位置（确定的）跨过一个酶切位点（比如sfcI）（在前两篇文章中都有所提及）。这样，在Cas9成功编辑靶序列产生indels的时候，酶切位点一定会遭到破坏。这为后续的单克隆鉴定提供了便利。请看示意图（图9）：
图9
注意一点：PCR引物设计的时候确保PCR片段内部不要出现第二个SfcI的酶切位点。这样后面酶切的时候结果是唯一的。实验流程和鉴定结果应该是这样的（图10）：
↓
图10
对于WT，酶切是充分的，不会残留。而对于成功编辑的两个mixture：*1和*2，由于产生了indels，部分sfcI的位点造到破坏，sfcI切不动的。对于成功编辑的单克隆而言，应该是一点都切不动。后续鉴定只要这样的克隆去测序即可（图11，红色编号为阳性克隆）。
图11
TA克隆结果（图12）：
图12
三、其他Cas9，比如Cpf1和saCas9的设计
因为以上介绍的站点没用涉及Cpf1和saCas9，特别是saCas9（非常适合AAV介导的载体基因编辑）：http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html 这个网站兼容几乎所有类型的Cas9设计。
打开页面，输入要编辑区域的基因组序列，然后在PAM类型里选择你需要的Cas9类型，比如spCas9，saCas9以及cpf1等。其他条件默认设置即可，然后点击sunmit即可。非常傻瓜式的操作（图13，14）
在Cas9成功编辑靶序列产生indels的时候，酶切位点一定会遭到破坏
图13
图14
