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质粒快速扩增系统（phi29升级版）

质粒快速扩增系统

Plasmid Rapid Amplification Kit

RPK-02（100次）

本产品是一种利用随机引物和细菌复制系统扩增DNA的试剂盒。灵敏度极高，可以在1-2小时内将1pg-1ng质粒DNA扩增到μg级以上，或者1-3小时内将0.001-0.5 μl菌液（OD1.0）中质粒扩增至μg级。本试剂盒使用的DNA复制系统具有3’→5’核酸外切酶活性，保真性非常高，突变率比taq酶低3000倍以上。

该试剂盒制备的质粒DNA经单，双酶切后的产物和常规质粒酶切后的产物相同，可用于下一步连接反应。适用于质粒的亚克隆，转录模板DNA的制备，一代测序质粒模板制备等。

试剂盒成分（100次）：

操作步骤：

（1）质粒扩增

（使用新鲜菌液效果比较好，不要使用冻存时间过长的表达菌比如BL21扩增质粒）

      反应体系（20uL）

95℃加热3分钟（95℃加热时间过长会产生非特异性扩增，），取出后放冰上或者直接4000-8000g离心 1分钟，待冷却至室温以下后，加入1 μL酶，42℃反应1-3小时。反应结束后，70℃加热灭活10分钟。

（2）扩增质粒检测

以下两种方案可选：

1. 限制性内切酶切扩增质粒

配制限制性内切酶反应体系，加入1/5体积上述质粒扩增产物，酶切30-60分钟。扩增质粒片段可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。

（本试剂盒buffer兼容大部分NEB公司HF系列内切酶以及Fermentas公司快速内切酶，可以直接在反应体系中加上述酶，除此之

外的内切酶需要使用相应的buffer按上述操作将扩增产物稀释5倍）

酶切后产物片段和使用环状质粒酶切后产生片段完全一样。可以通过琼脂糖凝胶电泳切胶回收。

2. 制备一代测序模板

第一步产物中加入2U碱性磷酸酶，37℃反应30分钟，95℃ 3分钟灭活。取2-6 μL 反应液作为测序模板。

质粒扩增案例：

案例1：不同质粒在42℃扩增1或者2小时后，使用限制性内切酶单酶切后电泳图。

12：p011 T-vector, 16: PBI-CMV; 19: pET28a; 20: pIRES2-EGFP; 17: pACYC-dut1;14: pGL4.29; 18: pCAG; 15: pCOLD-I.

案例2：从不同浓度T载体质粒或含载体菌液中扩增质粒，1或2小时后单酶切检测扩增产物。1-6分别是T载体质粒1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 0.1 pg, 0.01 pg作为模板。7-12分别是OD1.0的含T载体的Trans1T1菌液稀释1，10，100，1000，10000，100000倍后取1 μl做模板。

案例3：含pmal-c5x质粒的菌液使用本试剂盒42℃扩增2小时后，加入2 U碱性磷酸酶37℃反应30分钟，95℃ 3分钟灭活。取6 μL 反应液作为测序模板，使用malE引物测序结果。