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昆虫杆状病毒
昆虫杆状病毒
杆状病毒（Baculovirus）被广泛用于在昆虫细胞中生产大量重组蛋白，因其具有以下优点：（1）适当的翻译后修饰，因为昆虫细胞是高等真核生物；（2）病毒基因组比较大，约130 kb，因此具有多个基因或大插入片段的高容量；（3）生物安全性高，因为野生杆状病毒不会感染人类；（4）强启动子Polyhedrin或p10驱动的蛋白产量非常高。我们开发出一系列专有技术和试剂，从病毒滴度、纯度、活性以及一致性等方面显著提升了杆状病毒包装工艺水平。
| 生产规格 | 总量 | 最小滴度 | 分装 | 价格（CNY） | 周期 |
| 昆⾍杆状病毒中量制备 | >106 PFU | >106 PFU/ml | 10x100 ul | ￥4,380.00 | 13-21天 |
| 昆⾍杆状病毒⼤量制备 | >107 PFU | >107 PFU/ml | 10x100 ul | ￥7,280.00 | 21-27天 |
我们提供的昆虫杆状病毒类型为AcMNPV毒株（Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus）。
我们的杆状病毒存储在DPBS缓冲液中，并采用干冰运输。收到病毒后，立即放置于-80℃，长期贮存至少6个月。杆状病毒放置于-20℃可保存一周。请避免反复冻融，因为这会导致病毒滴度大幅下降。
| 步骤 | 描述 | 时间 |
Transformation into E. coli cells | 将携带目的基因（Gene of Interest， 简称GOI）和Tn7转座位点的转移载体（Transfer vector）转化到特定大肠杆菌里，此菌株含有一个表达Tn7转座酶的辅助质粒（helper plasmid）和一个含有杆状病毒基因组序列的大质粒（即bacmid，约136 kb，在杆状病毒序列中有Tn7转座位点）。在该细菌里，转移载体上的目的基因转座到bacmid上，形成携带目的基因的重组bacmid。 | 第1天 |
Transfection into insect cells | 重组bacmid经过检测且序列无误后，将重组bacmid质粒DNA转染昆虫Sf9细胞。此时包装出来的为粗制的杆状病毒。 | 第4天 |
Virus amplification | 病毒扩增：使用粗制的杆状病毒再次感染包装细胞，从而扩大病毒产量。 | 第9天 |
Virus purification | 从培养上清中收集病毒颗粒。对于大规格包装，采用蔗糖离心进一步浓缩。 | 第14天 |
Quality Control | 我们采用基于qPCR的方法测定昆虫杆状病毒的滴度。 对于每一个我们生产的杆状病毒，质量控制均包括滴度测定（Titer determination）、微生物（细菌和真菌）检测（Bioburden test）、支原体检测（Mycoplasma test）。若转移载体同时编码一个荧光蛋白，我们还会将病毒进行细胞转导以测定相应的荧光表达情况（Transduction test）。 | 第15天及以后 |
交付周期是指订单接收到发货之间的时间，不包括需要客户提供任何物料（如病毒载体）的等待时间。
如需客户提供杆状病毒载体，请联系我们了解外来物品接收指南。请严格按照我们的指南来进行装运以免造成物品的任何延误和损坏。客户提供的所有材料均需经过QC检测，每一份材料附加检测费用。请注意，客户提供物品接收并通过QC之后生产才正式开始。
杆状病毒载体系统广泛应用于昆虫细胞中表达重组蛋白，它是真核表达重组蛋白最通用和最强大的系统之一。该系统特别有利于在真核宿主细胞中大规模制备重组蛋白。许多真核生物蛋白的翻译后修饰只能在真核细胞中发生（例如糖基化），或者需要真核细胞环境来进行正确折叠（例如膜蛋白质），而原核蛋白表达系统却没有这些功能。
杆状病毒是一种双链DNA病毒，通常会感染昆虫，特别是鳞翅目昆虫（moths, butterflies and skippers）。我们的克隆载体pBV是经优化的，可与来自AcMNPV（Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus）的穿梭载体（称为Bacmid）一起使用，该穿梭载体的野生型基因组大小为134 kb。
首先将目的基因克隆到含有强启动子的pBV载体上，目的基因表达盒与庆大霉素抗性基因的侧翼序列为Tn7转座子末端元件Tn7L和Tn7R。然后，将该载体转化到携带Bacmid穿梭载体和辅助质粒的大肠杆菌中。Bacmid穿梭载体是一个非常大的质粒，含有经修饰后携带lacZ基因的杆状病毒基因组和插入lacZ基因编码区的mini-attTn7位点。辅助质粒可以表达Tn7转座酶，由转座酶介导pBV载体上Tn7R和Tn7L的之间的区域转座到mini-attTn7位点，Tn7R和Tn7L的之间的区域是目的基因和庆大霉素抗性基因的表达盒。通过庆大霉素筛选和蓝/白筛选鉴定出重组的阳性克隆（由于lacZ表达，非重组菌落为蓝色，而由于转座子插入破坏lacZ，重组菌落为白色），纯化的重组Bacmid DNA可用于转染昆虫细胞以产生活的杆状病毒，进而产生目的重组蛋白。
最常用的杆状病毒重组蛋白表达细胞系是Sf9，来源于草地贪夜蛾（fall armyworm）的卵巢组织。该细胞系适用于各种培养条件，包括悬浮或单细胞培养以及无血清培养基。幼虫和其他鳞翅目细胞系也被广泛使用，也有一些关于杆状病毒可应用于哺乳动物细胞的报道。
有关该载体系统的更多信息，请参考以下文献。
| 参考文献 | 主题 |
|---|---|
| J Virol. 67:4566-79 (1993) | Generation of recombinant baculovirus by site-specific transposon-mediated insertion |
| Meth. Mol Med. 13:213-35 (1998) | Generation of recombinant baculovirus DNA in E.coli using a baculovirus shuttle vector |
| Nat Biotech. 23: 567–575 (2005) | Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells |
我们的杆状病毒重组蛋白表达载体系统能够在昆虫细胞中高效生产重组蛋白，该系统表达的蛋白具有真核细胞的翻译后加工特征，且能够进行大规模生产应用。
真核系统：昆虫细胞可进行类似于哺乳动物细胞的蛋白翻译后加工。因此，我们的系统特别适用于表达需要进行适当的转录后加工的真核生物蛋白，而原核表达系统并不具备这一功能，如共价修饰或膜定位。
高水平表达和可溶性：在大多数情况下，目的蛋白是高度表达的，可溶性的，并且可以很容易地从感染细胞中进行纯化回收。
易于放大规模：在我们的系统中，获得的初始杆状病毒可用于感染更多细胞以进一步提高病毒滴度。因此，利用我们的系统易于放大蛋白生产规模。
悬浮培养：Sf9和其他鳞翅目细胞系易于悬浮培养，使其能够在生物反应器中大规模生产重组蛋白。
安全性：杆状病毒不能在除了昆虫细胞以外的细胞进行复制，对哺乳动物和植物无致病性。因此，可以在最小生物安全条件下使用我们的杆状病毒重组蛋白表达系统。
技术复杂：使用杆状病毒表达系统进行蛋白生产需要多个步骤，包括将目的基因克隆到pBV载体上，产生重组Bacmid，并将重组Bacmid DNA转染昆虫细胞。相对于细菌重组蛋白表达系统，该系统对技术要求更高，且耗时更久。在订购载体的同时，可以通过订购我们的重组Bacmid制备和病毒包装服务轻松解决这些问题。
