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筛选A459 circRNA稳定过表达细胞株

近年来,随着对circRNA研究的深入,circRNA的重要性逐渐得到认识。circRNA在各种组织和细胞均有广泛分布,并且体现出组织差异性。研究表明,circRNA具有miRNA海绵、调节miRNA表达、部分circRNA具有蛋白翻译功能等多种功能。
最新的研究表明,circRNA的产生是一个缓慢的过程。由于环状RNA比较稳定,在一个相对长的时间内慢慢累积,从而达到较高丰度(Zhang Y,et al.Cell Rep. 2016)。因此,慢病毒系统构建稳转细胞株特别适合环状RNA表达研究。在细胞中稳定转入circRNA表达结构,长期稳定表达circRNA,才能较好的模拟环状RNA的体内表达状态和功能。
靖瑞百康生物的慢病毒circRNA表达载体,可以大幅稳定提高circRNA表达量,精确表达指定circRNA。环化效率极高。特别适合circRNA的功能研究。

实验方案:将目的circRNA编码DNA构建到慢病毒circRNA表达载体。包装为慢病毒后转染A549细胞,筛选出稳定过表达目标circRNA的A549细胞株。

pLV-circ-Luci(2A)puro载体图谱:

图1、载体图谱



图2、circRNA表达框

实验步骤:

  1. 将目标circRNA编码序列及其两端部分内含子序列通过酶切连接插入到慢病毒circRNA表达载体pLV-circ-Luci(2A)puro。

  2. 将空载体pLV-circ-Luci(2A)puro及circRNA表达载体pLV-circRNA分别包装为病毒。

  3. 转染A549细胞。用puromycin筛选出稳定细胞株。

  4. 通过qPCR检测circRNA表达。

检测结果: 
1、设计引物分别检测目标环状RNA及总RNA(环状RNA+线性RNA)。


图3、qPCR引物位置示意图

 


图4、qPCR检测circRNA过表达A549细胞及其对照细胞中目标环状RNA及总目标RNA表达。结果显示与对照组相比,目标环状RNA表达量显著增高。

 

2、circRNA qPCR产物测序结果

图5、circRNA qPCR产物测序结果显示环化部分剪切正确,序列与预期一致。

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货号

品名

VL3531

pLV-circ-puro载体

VL3532

pLV-circ-Luci(2A)puro载体

VL3533

pLV-circ-sfGFP(2A)puro载体

VL3534

pLV-circ-tagRFP(2A)puro载体

W4002

circRNA稳转细胞株筛选服务



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